Ursprünglich gab es an der Südbahn drei Bahnbetriebswerke: Ulm, Aulendorf und Friedrichshafen. Von diesen ist nur noch Ulm übrig geblieben, die anderen fungieren nur noch als Personaleinsatzstellen.
Über den Betrieb vor dem zweiten Weltkrieg liegen mir leider keine Informationen vor.
Der Schnellzugverkehr wurde zunächst mit der württemberigeschen Lokbaureihe C (BR 18.1) bestritten, ab 1953 erfolgte der Einsatz der bayerischen S 3/6 (BR 18.4) später der Schwesterlokomotiven mit Neubaukessel der BR 18.6. Ab 1961 wurde von Ulm aus die Einheitsbaureihe 03 eingesetzt. Ab 1954 beheimatete Ulm auch Loks der preussischen BR P 8 (BR 38) die auch im Personenverkehr auf der Südbahn eingesetzt wurden. Im Nahverkehr wurde zuerst die württembergische T 5 (BR 75.0) später die Einheitsloks der BR 64 eingesetzt. Der Güterverkehr wurde mit Lokomotiven der BR 50 abgewickelt. Bis auf die Nahverkehrsmachinen waren alle Loks ab beginn der 60er Jahre in Ulm beheimatet.
Der Einzug der Dieseltraktion im Streckendienst erfolgte ab 1963 mit den Loks der Reihe V 100 (BR 211/212) ab 1966 kam die Baureihe V 160 (BR 216), diese wurden in Ulm durch die BR 215 abgelöst, inzwischen beheimatet Ulm auch Loks der Baureihe 218. Zeitweise waren auch Loks der BR V 200.1 (221) aus Kempten auf der Südbahn im Einsatz, heute kommen von dort auch nur noch 218. Ein Teil der Züge wurde auch zeitweise mit Loks des BW Haltingen (bei Basel) befördert.
Für die 1995 eingeführten Interregiosteuerwagen wurden eigens vier Lokomotiven der BR 218 auf ZWS-Wendezugsteuerung umgebaut, diese Maschinen wurden weiter von DB-Regio unterhalten und an den Geschäftsbereich Fernverkehr für die Interregio-Leistungen vermietet.
Bisher dominieren im lokgeförderten Zugverkehr Loks der Baureihen 215 und 218 aus Ulm, teilweise auch 218 aus Kempten. Nachdem zum Fahrplanwechsel 1999 alle Kleinloks auf den Unterwegsbahnhöfen abgezogen wurden wird der restliche Ortsgüterverkehr mit Loks der BR 290 abgewickelt. Für den Güterfernverkehr nach Österreich, werktäglich sind das einige Zugpaare, standen bisher keine Loks von DB-Cargo zur Verfügung, es wurden vielmehr die in Ulm vorhanden Maschinen von DB-Regio verwendet. Inzwischen hat sich das aber etwas gewandelt, da Regio nicht mehr alle 215 für den Nahverkehr benötigt werden diese zum Teil an Cargo abgegeben. Teilweise wurden diese Maschinen umgebaut oder auch nur umbeschriftet und tragen jetzt die Baureihennummer 225.
Nachdem zum Fahrplanwechsel der IR-Verkehr auf der Südbahn weitgehend eingestellt wurde, sind die Lokomotiven mit ZWS-Ausrüstung nach Mühldorf abgegeben worden, da diese dort führ Doppelstockwendezüge benötigt werden. Das verbleibende IR-Paar wurde daher mit Lokomotiven aus Mühldorf befördert. Diese wurden über Lindau zugeführt und beförderten neben dem letzten IR noch ein bis zwei IRE-Züge auf der Südbahn. So kamen bisher Ulmer, Kemptener und Mühldorfer Loks der BR 218 auf der Südbahn zum Einsatz.
Da mit dem Fahrplanwechsel im Dezember 2002 auch das letzte IR-Zugpaar abgeschafft wurde, entfällt jetzt auch der Einsatz der Mühldorfer ZWS-Loks. Der neu eingeführte IC wird mit einer Lok der Baureihe 234 gefahren, es ist der erste Einsatz dieser Baureihe im Personenverkehr auf der Südbahn.
Seit Januar 2002 kommen im Güterverkehr Loks der Baureihe 232 zum Einsatz. Die Maschinen gehören zum Betriebshof Kornwestheim, werden aber von Ulm aus eingesetzt. Sie sollen zunächst Doppeltraktionen der BR 225 vor Ölzügen ersetzten, evtl. soll aber die BR 215/225 komplett durch Loks der Reihe 232 ersetzt werden.
An Triebwagen waren schon seit den 60er Jahren die Scheinenbusse der Baureihen VT 959 (BR 795)und VT 989 (BR 798) eingesetzt, in Friedrichshafen waren vier VT 605 stationiert. Später kamen von Kempten aus auch die Prototypen der neuen Baureihen 627 und 628.0 später auch 628.1 im Nahverkehr zwischen Friedrichshafen und Ravensburg bzw. Aulendorf zum Einsatz. Nachdem die Serienausführung des 628.2 auch in Kempten Einzug gehalten hatten kamen auch diese auf die Südbahn. Nachdem die DB Anfang der 90er Jahre den gesamten Schienennahverkehr eingestellt hatte, waren die Triebwageneinsätze bis auf Tagesrandverbindungen beendet.
Auch heute beschränkt sich der Triebawageneinsatz nur auf Tagesrandverbindungen mit den Baureihen 628 und 611, letztere fahren auf der Südbahn nicht bogenschnell, da diese Strecke nicht dafür ausgebaut ist, vielmehr dienen diese Fahrten der Anbindung der Triebwagen an ihren Heimatbetriebshof Ulm. Seit 1999 kommen auf dem nördlichen Abschnitt von Ulm bis Biberach, teilweise weiter bis Aulendorf, die von dem DB-Tocherunternehmen RAB eingesetzten Regioshuttle, von der DB als BR 650 geführt, zum Einsatz. Den selben Fahrzeugtyp setzt auch die Hohenzollerische Landesbahn (HzL) im Auftrag der DB für Regionalzüge zwischen Aulendorf und Ulm ein. Außerdem wird dieser Triebwagentyp auch von der Bodensee-Oberschwaben-Bahn (BOB) für den Nahverkehr zwischen Friedrichshafen und Aulendorf eingesetzt. So kann man in Aulendorf allen drei Farbvarianten der Regioshuttle begegnen.